Virusinfeksjoner hos fisk

---

Innhold

• Infeksiøs pankreas nekrose (IPN)
• Infeksiøs lakseanemi (ILA)
• Pankreassykdom (PD)
• Kardiomyopatisyndrom (CMS)
• Hjerte- og skjelettmuskelbetennelse (HSMB)

---

Infeksiøs pankreas nekrose (IPN)

I 1940 ble det beskrevet en akutt, katarralsk enteritt hos bekkerøye i Canada (9) og dette er trolig den første beskrivelsen av sykdommen. Infeksiøs pankreas nekrose virus (IPNV) ble isolert i cellekultur for første gang i 1958 og er det første fiskepatogene viruset som ble dyrket i cellekultur (10). I Norge ble IPNV påvist første gang i 1975 fra regnbueørret og i 1985 ble det første IPN-utbruddet påvist hos atlantisk laks (11). På slutten av 1980-tallet ble IPNV isolert fra 95 % av alle undersøkte norske anlegg. I perioden 1994-2000 hadde mellom 40 og 70 % av matfiskanleggene utbrudd av IPN.  

Epidemiologi og smitteveier

IPN påvises både i ferskvann og sjøvann, og har en global utbredelse. IPN er en sykdom hos laksefisk i oppdrett og er beskrevet som et problem i særlig grad i Norge, Skottland og Chile. IPN virus er typestammen innen akvatiske birnavirus (Aquabirnavirus), og det er isolert akvatiske birnavirus fra minst 32 ulike familier av fisk, både oppdrettsarter og villfisk (12). I oppdrett er IPNV infeksjon hovedsakelig et problem hos atlantisk laks, regnbueørret, brunørret og bekkerøye, men også hos andre aktuelle oppdrettsarter som torsk, kvite, piggvar, flekksteinbit og ål er det rapportert om klinisk sykdom og død knyttet til infeksjon med IPNV (12). Viruset kan også infisere virvelløse arter. 

IPNV infiserer via gjeller og tarmslimhinne, men muligens også over hud. Viruset replikerer i cellenes cytoplasma og primært replikasjonssted er i nyre og muligens milt (13). Etter en første runde med oppformering av virus spres det med blodet og infiserer pankreas og lever. Det er sannsynlig at IPNV overføres vertikalt hos atlantisk laks, men dette er ikke endelig dokumentert. Hos regnbueørret derimot er det vist at viruset infiserer eggene og nedregulerer interferon hos fiskelarven (nedregulering av immunresponsen). 

Ved siden av vertikal overføring av virus, som kan skje i rognvæske (ekstra-ovum) eller inne i egget (intra-ovum), kan yngel smittes ved å spise eggeskallet eller ved å ta opp virus fra eggeskallene etter klekking. Dette harmonerer med at IPN ble først kjent som et sykdomsproblem hos yngel av laksefisk i forbindelse med startfôring (10). Ved siden av infeksjon hos startfôringsyngel representerer IPN et problem hos 5–20 gram yngel/parr i ferskvann, og hos postsmolt 4–8 uker etter sjøutsett. Sykdom i settefiskfasen nært opp til startfôring knyttes til vertikal overføring, mens opptreden av IPN senere i settefiskfasen er satt i sammenheng med «hus-stammer» av IPN virus i de ulike settefiskanleggene og hvor biofilm/belegg i rør/rørgater etc. utgjør en mulig smittekilde. Desinfeksjon av settefiskanlegg har vært benyttet som en vellykket bekjempelse av IPN. Utbrudd etter utsett i sjø skyldes en reaktivering av en persistent infeksjon som stammer fra settefiskfasen (14). 

Innen anlegg kan utstyr fungere som mekaniske vektorer for overføring av infeksjon og god hygiene står sentralt i forebyggelse/kontroll. I settefiskanlegget bør utstyr kun benyttes i dedikerte kar for å redusere spredning av virus fra et kar til et annet. Transport av fisk i f.eks. brønnbåt utgjør også en risiko for smittespredning. 

Antall påvisninger av IPN hos atlantisk laks og regnbueørret i oppdrett har falt siden 2010 med introduksjon av en seleksjonsmarkør for IPN resistens (IPN-QTL). De siste 7-8 årene har antall rapporterte tilfeller vært 20-25 pr år (Figur 1).  

Friske smittebærere

Fisk som overlever infeksjon med IPNV kan bli persistent infiserte og skille ut virus i varierende mengde over i lang tid. Det er vist at yngel som ble infisert med IPNV tre uker etter klekking kunne være bærere i inntil 6 måneder. Persistent infisert fisk kan ha sirkulerende antistoffer mot IPNV, og de utvikler ikke klinisk sykdom ved reinfeksjon. Hos frisk fisk kan det være opptil 10⁵ infeksiøse viruspartikler pr gram nyrevev (15) og friske smittebærere kan i perioder skille ut virus i feces og reproduksjonsprodukter. Replikasjon av viruset i makrofager i hodenyret er trolig viktig for å opprettholde bærertilstanden. Atlantisk laks i ferskvann som er eldre enn 6 måneder (1500 døgngrader) regnes som ikke mottakelig for infeksjon.  

Klassifisering

IPNV tilhører familien Birnaviridae (16) som er inndelt i fire genera, Aquabirnavirus, Avibirnavirus og Entomobirnavirus og Blosnavirus. IPNV tilhører førstnevnte, mens virus innen de to andre genera infiserer henholdsvis fugler og insekter. Akvatiske birnavirus kan forårsake sykdom hos andre arter enn laks. Ofte vil man da ikke finne forandringer i pankreas. Selv om viruset er identisk med det som gir IPN hos laks, er den korrekte betegnelsen i disse tilfellene akvatiske birnavirus, ikke IPN-virus.  

Det finnes to serogrupper akvatiske birnavirus, gruppe A og B. I serogruppe A er det 9 serotyper, mens det i gruppe B er én serotype (12, 16). Etter sekvensering av genomet til IPNV har man klassifisert akvatiske birnavirus i 7 ulike genogrupper. Norske isolater fra atlantisk laks tilhører serotype A2 (ofte referert til som serotype Sp), genogruppe V. 

Struktur

Birnavirus er et nakent nakent virus med kapsid med ikosaedrisk symmetri (16, Figur 3). Kapsidet består av ett enkelt skall, hovedsakelig bygget opp av VP2 og VP3 (Figur 4). Diameteren er ca. 60 nm og tettheten 1,33 g/cm3 i CsCl. Segmentene benevnes A og B, og koder for fem proteiner (VP1 – VP5). 

Segment A

Segment A for IPNV serotype A2 består av 3097 basepar og koder for et polyprotein som igjen koder for virusproteinene VP2, VP3, VP4 (NS-protease) og VP5. De to sistnevnte (VP4 og VP5) er detektert i infiserte celler, ikke i modne viruspartikler (ikke-strukturelle proteiner).

VP2 er virusets kapsidprotein (16) og induserer dannelsen av virusnøytraliserende antistoffer. VP2 er bestemmende for serotyping. VP3 er et internt, strukturelt protein som sannsynligvis interagerer med/binder virusets genom (16). VP4 forårsaker spalting av preVP2-VP4 og VP4-VP3. Den videre prosessen fra preVP2 til VP2 står cellens proteaser for. Funksjonen til VP5 er ikke kjent, men man antar at proteinet hos noen serovarianter bidrar til å lette produksjonen av nye viruspartikler ved å hindre vertscellen i å gå inn i apoptose. For IPNV serotype Sp er det vist at VP5 ikke har disse egenskapene (17).

Segment B

Segment B koder for den RNA-avhengige RNA-polymerasen og betegnes VP1 (16). VP1 er ansvarlig for replikasjon av virusgenomet under en infeksjon. VP1 finnes i fri form inne i kapsidet og bundet kovalent til hvert genomsegment og initierer transkripsjonen etter infeksjon.

Tabell 1. Oversikt over IPNV polypeptider. Av Aja Nafstad (2012).

RNA-segment	Protein	Funksjon
B	VP1	RNA-avhengig RNA polymerase
A	preVP2	–
A	VP2	Kapsidprotein
A	VP3	Indre strukturelt protein
A	VP4	Protease
A	VP5	Ukjent

Overlevelse

Akvatiske birnavirus er nakne og er uten ytre membran. Dette gjør dem svært robuste mot ytre påkjenninger og IPNV er et av de mest stabile/robuste fiskevirus som finnes. Det kan overleve i både ferskvann og sjøvann i lange perioder. IPNV tåler UV-stråling (5 min ved 254 nm) og tørke i ca. 4 uker. UVC-stråling reduserer infektiviteten til ca. 10 % ved 10⁶ rad doser. Viruset er også stabilt i syre, kloroform, eter og glyserol. Ved pH 3 er viruset infektivt i ca. 30 min, mens det ved pH 9 kan være infektivt i flere timer. Jod, klor, formalin og ozon reduserer infektiviteten til IPNV og inaktiverende effekt av de ulike kjemikalier er avhengig av konsentrasjon og eksponeringstid.

Virulens

Stammer som er virulente ovenfor IPN-QTL^-/- individer har threonin i posisjon 217 og alanin i posisjon 221. Moderat virulente og lavvirulente stammer har også alanin i posisjon 221, men prolin i posisjon 217. Stammer med treonin i posisjon 221 er tilnærmet avirulente (18). 

Tabell 2. Kombinasjoner av aminosyrer i indikerte posisjoner i VP2-proteinet og virulens for de ulike varianter, testet overfor atlantisk laks, IPN-QTL^-/-. Av Øystein Evensen.

Aminosyre-posisjoner i VP2 proteinet			In vivo virulens
217	221	247
T	A	T	Høyvirulent
T	T	T	Avirulent (tilnærmet)
P	A	A	Lavvirulent
P	T	A	Avirulent (tilnærmet)

Det er grunn til å tro at disse posisjonene i VP2 har betydning for binding til reseptor(er) og opptak av virus i cellen (16).

Klinikk og patologi

Dødeligheten ved IPN varierer fra 0 til nesten 100 % i ferskvann og fra ubetydelig til ca. 70 % i sjøvann, men vil som regel ligge på. 5-10%, og dette gjelder for IPN QTL^-/- fisk. Lav eller høy dødelighet ved et utbrudd avhenger av verten (genetisk bakgrunn), miljøet og virusets egenskaper. Hos verten er blant annet alder, helsestatus og art av betydning. Avgjørende faktorer i miljøet er forhold som gir stress, for eksempel dårlig vannkvalitet, høy vanntemperatur, salinitet, ugunstige strømningsforhold, for stor tetthet, m. fl.

Forløpet for IPN varierer fra subklinisk til akutt. Ved subklinisk sykdom sees gjerne lav dødelighet over lang tid. Ved det klassiske sykdomsforløpet sees både kliniske symptomer og patologiske forandringer hos fisken. Det mest karakteristiske tegnet på at fisk er hardt angrepet av IPNV er svømming med korketrekker-bevegelser. Dette forekommer i de siste stadiene av sykdommen og sees sjelden under praktiske forhold, mens unormal svømmeatferd observeres oftere. Utspilt buk på grunn av ascites og mørkere pigmentering er kliniske tegn på akutt IPN. Moderat exophtalmus (utstående øyne) og finneråte er også forholdsvis vanlige funn ved et utbrudd. Det kan henge gulhvite tråder av faeces og avstøtt tarmslimhinne fra gattet. Disse trådene vil også sees ved obduksjon av tarmen som ellers er tilnærmet tom. Fisken blir mager dersom sykdomsforløpet varer over en viss tid. Ofte finnes ventrale blødninger, gjerne ved finnebasis på bukfinnene. Gjellene er bleke og hematokrittverdien lav på grunn av blødningene. Organene som rammes ved akutt infeksjon er pankreas, lever og fremre del av tarmen. Makroskopiske forandringer sees derfor hovedsakelig i disse organene.

Fisk som overlever den akutte sykdomsfasen vil ofte bli ”tapere”, siden IPNV angriper de eksokrine delene av pankreas og produksjonen av fordøyelsesenzymer hemmes. Fisken vil dermed avmagres tross god matlyst siden evnen til å fordøye fett og proteiner blir nedsatt.

Histopatologi

De histopatologiske forandringene finnes i pankreas og lever. I pankreas gir infeksjonen nekroser av multifokal eller diffus karakter i eksokrin pankreas (Figur 6). Den endokrine delen av pankreas vil ikke være affisert. Hos mottagelig laks ses initielt en kombinasjon av nekrose og apoptose. Sannsynligvis resulterer infeksjonen først til apoptose i eksokrine pankreasceller som sekundært går over til en nekrose (Figur 6) Cellene blir avrundet og nukleus kondenseres (pyknotisk). Mellom cellene sees vakuoler og vev et mister sin struktur (Figur 6). Etter hvert vil hele strukturen til pankreas viskes ut og forandringene kan også angå omkringliggende fettvev, gjerne med blødninger, dels med diffus utbredelse.

I fremre del av tarmen og pylorusblindsekkene sees nekroser og epitelavstøtning som følge av akutt enteritt.

Diagnostikk

Hos symptomfri fisk kan det finnes opptil 10⁵ infeksiøse viruspartikler pr. gram vev i pankreas. Dersom virus-titeret er mellom 10⁶ og 10¹⁰ indikerer det at IPNV er årsaken til dødeligheten. Ved mistanke om sykdom skal det tas prøve fra svimere. Det skal tas prøve av pankreas og lever på formalin. I laboratoriet blir disse undersøkt både ved histopatologi og immunohistokjemi (Figur 7). For å stille diagnosen må det være karakteristiske vevsskader i eksokrine pankreas, samt identifikasjon av IPNV ved immunhistokjemi i disse lesjonene. En diagnose kan også stilles ved PCR analyse.

Bekjempelse av IPN

Stamfisk og rogn

Som tidligere nevnt kan IPNV overføres vertikalt hos regnbueørret, men det er ikke endelig bevist for atlantisk laks, selv om det etter all sannsynlighet også forekommer vertikal overføring hos atlantisk laks. Hodenyre fra stamfisk testes for IPNV sammen med rognvæske. Rogn bør desinfiseres slik at virus i kjønnsvæsker på rognens overflate inaktiveres.

Driftsrutiner og epidemiologiske forhold

IPN i ferskvannsfasen er bestemmende for de problemer man opplever etter sjøsetting. Derfor blir tiltak som settes i verk i ferskvann være viktige for senere opptreden av klinisk sykdom. Gode forhold på settefiskanleggene er en forutsetning for å få kontroll over alle smittsomme sykdommer, inkludert IPN. Fisken bør stresses så lite som mulig og dette gjelder forhold som vannkvalitet, strømningsforhold, temperatur, pH, ammoniakk (særlig resirkuleringsanlegg). Rutiner for desinfeksjon skal være gode, og sanering/desinfeksjon av kar og utstyr skal gjøres før de tas i bruk til ny fisk.

I dag anser man at IPN etter sjøsetting er et problem som man «drar på seg» i ferskvannsfasen. Smitte skjer enten vertikalt (særlig fra mordyr) og kliniske utbrudd ses særlig kort tid etter startforing. I tillegg forekommer det infeksjon i settefiskfasen og det antas at hovedkilden til smitte er det enkelte settefiskanlegg, dvs. det finnes ulike «husstammer» av IPNV i de ulike anleggene. Dette har man vist ved genotyping av IPNV isolater fra ulike settefiskanlegg og det er mulig å spore virus helt ut i sjøfasen. Dette betyr at det i liten grad skjer en nysmitte etter sjøsetting; problemet er noe man drar med seg fra ferskvannsfasen, men spredning innen og mellom anlegg kan forekomme.

I dag foretas det screening av stamfisk (før innleggelse av rogn) samt at mange settefiskanlegg også kjører regelmessig screening for IPNV ved bruk av real-time PCR metoder. Disse analysene er ikke rettet inn mot å påvise sykdom, men brukes for å påvise forekomst av infeksiøst agens. Påvisning av IPNV vil medføre ulike tiltak, fra utslakting/destruksjon av batcher av yngel, restriksjoner på transport/overføring til andre anlegg etc.

Utbrudd etter sjøsetting forekommer i den perioden hvor fisken er mest belastet gjennom endring av ytre miljø (stress), men hvilke faktorer som er utslagsgivende er ikke helt kjent. Generelt vil anbefalingen være å optimalisere de miljømessige forholdene (unngå stress så langt det lar seg gjøre), bekjempe infeksjonen i ferskvannsfasen og derigjennom hindre eller redusere mulighetene for oppformering av virus i mottagelige individer.

IPN-QTL rogn

Hos atlantisk laks er det identifisert et område på genomet (QTL) som forklarer 90 % av den genetiske variasjonen i mottakelighet for IPN. Denne kunnskapen benyttes i avlen for å få frem laks som er mer motstandsdyktig mot IPN. Dette sammen med bedrede driftsrutiner og vaksinasjon, har resultert i at antall tilfeller er redusert til 1/5 av hva det var for noen år siden (Figur 10). Det er vist at spesifikke mutasjoner i det som antas å være reseptoren for virus, E-cadherin proteinet, assosieres med økt resistens overfor infeksjon. Dette er illustrert i Figur 10 hvor det vises en økende grad av resistens med økende homozygoti for resistensmarkøren mot IPN.

I de siste årene (fra 2018-19) har det vært rapportert om dødelighet som skyldes IPNV infeksjon også hos IPN-QTL fisk. Dette er varianter som har mutasjoner i ulike posisjoner i VP2 proteinet, og alle har en P₂₁₇T₂₂₁ kombinasjon. Dødeligheten ved påvisning av IPNV er ikke høy, men forhøyet relativt hva man har observert over de siste årene hos IPN-QTL fisk.

Vaksinasjon

Den første vaksinen mot IPN kom på markedet i 1995, men selv en ustrakt bruk av vaksinen førte ikke til en vesentlig nedgang i antall rapporterte tilfeller av IPN. Imidlertid har produksjonen av laks økt betraktelig uten at det blitt en økning i antall utbrudd, noe som kan indikere at vaksinen gir en viss beskyttelse mot klinisk sykdom. Laboratoriestudier viser at IPN-vaksinen gir god immunitet og beskyttelse mot dødelighet, men observasjoner fra felt er mindre overbevisende, dog ikke konsistente. Ved hjelp av ELISA har man målt antistoffresponsen etter vaksinering mot IPNV (eksperimentelle vaksiner) og fått resultater som indikerer at det er sammenheng mellom antistoffrespons og beskyttelse mot dødelighet (13).

Det finnes ulike varianter av IPNV med varierende virulens og varierende evne til å gi antistoffrespons (immunogenisitet). Det er kryssimmunitet mellom ulike varianter av IPNV (13), og de mest virulente variantene er også de som gir best immunitet og beskyttelse mot eksperimentell smitte.

Nedgang i antall tilfeller av IPN over de siste årene

Det har vært en nedgang i antall tilfeller av IPN siden 2010 (Figur 11). Dette skyldes en kombinasjon av økt bruk av QTL-rogn, bedre driftsrutiner med uttalt testing for IPNV infeksjon hos stamfisk og ikke minst i testing for forekomst av hus-stammer i ulike settefiskanlegg, samt uttalt bruk av vaksiner. Introduksjon av IPN-QTL resistensen har i størst grad bidratt til redusert antall tilfeller og langt mer enn det som ble oppnådd med vaksinasjon over de siste 20 årene.

Infeksiøs lakseanemi (ILA)

ILA-historikk

Infeksiøs lakseanemi ble påvist første gang i et smoltanlegg i Norge i 1984. Et nytt utbrudd ble påvist året etter og de etterfølgende årene var det en kraftig stigning i antall tilfeller fram til 1990, med 80 rapporterte tilfeller (Figur 12). Gjennom ulike tiltak sank antallet tilfeller, og over de siste 15 årene har man hatt 5-10 påviste tilfeller av ILA årlig.

Det første sykdomstilfellet utenfor Norge ble påvist i Canada i 1996, etterfulgt av et stort utbrudd i Skottland i 1998. Færøyene hadde sin første påvisning i 2000. Dette var starten på en epidemi som varte helt til 2005 og som nesten utryddet lakseindustrien på Færøyene. I Chile ble ILA først påvist på Coho laks i 1999. I 2007 og utover i 2008 ble det registrert et økende antall tilfeller av ILA i Chile. I 2009 gikk antallet ned og i 2010 ble det påvist kun 2 kliniske tilfeller av ILA.

I 1989 ble ILA listeført som en meldepliktig gruppe B-sykdom og i de påfølgende årene ble flere tiltak satt i gang:

• ○ 1989:
  • • Helsekontroll i klekkeriene
• • • Desinfeksjon av egg
• • • Forbud mot bruk av sjøvann i klekkeriene
  • • Forbud mot flytting av fisk som allerede var satt i sjøen
• ○ 1990:
  • • Regulering av transport og desinfisering av brønnbåter
  • • Genereasjonskifte (alt inn/alt ut) innført på frivillig basis
• ○ 1991:
  • • Reguleringerer for desifisering av sjøvann til bruk i klekkeriene
  • • Kontroll og innsamling av dødfisk til ensilering
• ○ 1992:
  • • Introduksjon av lokalsoner til bruk i bekjempelsen av utbrudd.

Viruset

ILA-viruset tilhører arten Isavirus i virusfamilien Orthomyxoviridae, nært beslektet med influensavirus. ILA er kappekledd med to sentrale overflateproteiner, hemagglutinin-esterase- og fusjonsproteinet. Hemagglutinin-esterase er ansvarlig for reseptorbinding og reseptorfrigjørelse, mens fusjonsproteinet er ansvarlig for at viruset tas opp i cellen den infiserer. Genomet til ILA-viruset består av åtte negative enkelttrådede RNA segmenter, samlet ca 14,3 kb.

HPRO

En region i hemagglutinin-esterase proteinet som benevnes “Highly polymorphic region” (HPR), har betydning virusets virulens. I full lengde er denne regionen på 35 aminosyrer og betegnes da HPR0. Disse variantene av viruset er avirulente, men ved delesjoner i regionen blir viruset virulent. Alle ILAV isolater som er påvist ved kliniske utbrudd har delesjoner i HPR regionen, i varierende grad. HPR0 er påvist i flere land, blant annet Skottland, Norge, Chile og på Færøyene. Ved testing av nyreprøver fra friske populasjoner av laks påvises HPR0 varianten i 0,9 % av undersøkte individer. Ved testing av gjelleprøver påvises mer enn 10% positive individer i en frisk populasjon (4). HPR0 er også påvist hos villaks. HPR0 er en risikofaktor for kliniske utbrudd av ILA.

Sykdommen

ILA-utbrudd ses i sjøvannsfasen og kan forekomme i settefiskanlegg som har tatt inn sjøvann. Fra et anlegg blir smittet til man observerer sykdom kan det gå fra to til flere uker. Likeledes kan det ta lang tid fra man ser sykdom i en merd til man observerer klinisk sykdom i nabomerden. Dette trenger likevel ikke bety at fisken i nabomerden ikke er smittet. Dødeligheten vil som regel være relativt lav, gjerne rundt 0,5-1 promille per dag.

Patogenesen

Sykdom oppstår som en følge av en mutasjon i HPR regionen til viruset. Slike forandringer er sannsynligvis gradvise, dvs. at det skjer en gradvis akkumulering av mutasjoner i flere segmenter hos viruset. En punktmutasjon i F-proteinet (fusjonsproteinet) er knyttet til overgangen fra en HPR0 til en virulent HPR-delta. Hvor mange mutasjoner eller om noen mutasjoner er viktigere enn andre for overgangen fra avirulent til virulent profil er ikke kjent.

HPR0-varianten av ILA-viruset infiserer epitelceller i gjeller (Figur 13) og i hud (epiteliotropt, Figur 14). Ved mutasjon fra HPR0 til HPRdel endres virusets tropisme og endotelceller vil også infiseres (Figur 15), men HPRdel varianten kan også infisere epitelceller. Infeksjonen blir systemisk, med uttalte endotelcelleskader i indre organer.

Infektivt og virulent virus spres fra fisk til fisk ved utskillelse gjennom hud/slim. Infeksjonsporten hos naive individer er sannsynlig ytre overflater (hud/gjelle). Ved systemisk infeksjon infiseres endotelcellene og disse skades under virusreplikasjon/-frisetting. Skadene i karene/endotelcellene gir blødninger og blodstuvning. Dette skjer oftest i lever, nyre, tarm og gjeller. Blødningene vil etter hvert føre til en alvorlig anemi med hematokritt (blodprosent) under 10.

I tillegg vil viruset feste seg til de røde blodcellene og begrense deres levetid slik at anemien forverres. Etter hvert får fisken mest sannsynlig en sirkulatorisk kollaps med påfølgende ischemi og store organskader som den til slutt dør av.

ILA-diagnostikk

Ved observert økt dødelighet eller mistanke om sykdom skal helsetjeneste kontaktes for risikobasert helsekontroll. Mistanke om ILA kan framsettes på bakgrunn av letargisk/apatisk/sløv fisk som ligger i bunnen eller henger langs sidene i merda. De makroskopiske forandringene består av blødninger på buken og ved basis av finner. Fisken er anemisk med bleke gjeller, blekt hjerte, lav hematokritt, mørk lever, petecchier i fettvev og i tarmvegg, stuvning og blødning i øyekammeret kan forekomme.

En eventuell mistanke om ILA kan oppheves ved inspeksjon og prøveuttak i regi av Mattilsynet en gang per måned i inntil et halvt år uten at mistanken stadfestes.

Ved mistanke om ILA, diagnostisering og bekjempelse så gjelder i korte trekk følgende. Kriterier som kan legges til grunn for offisiell mistanke hos Mattilsynet er et av følgende:

• ○ Obduksjon eller histologi med tegn på ILA med eller uten kliniske funn
• ○ Påvist virus med PCR (HPRdel-variant), immunhistokjemi eller virusdyrking (to uavhengige tester)
• ○ Flytting av fisk med mistanke om eller påvist ILA
• ○ Kontakt med smitta anlegg 

Prøver som ligger til grunn for undersøkelsen og hvilke prøvesvar bekrefter diagnosen ILA:

• ○ Prøver fra 5-10 fisk (individuelt merket), klinisk syk, ikke utpreget taperfisk
• ○ Formalin-fiksert (for histologi og IHC) – her brukes betegnelsen «fullt organsett»
  • • Gjeller
  • • Hjerte
  • • Lever
  • • Pankreas/tarm
  • • Milt
  • • Nyre
  • • Hud/muskel

I tillegg (her gjelder prinsippet om påvisning med to uavhengige metoder så alle prøver må ikke tas):

• • Hjerte og nyre på RNAlater (for RT-PCR)
• • Hjere og nye på transportmedium (for dyrking)
• • Bloprøver på heparin for anti-ILAV deteksjon
• • Imprint fra midtnyre på poly-L-lysine coatet slide for IFAT 

Kriterier for diagnose: Påvisning av både sykdom og agens i samme individ – dvs.

1. Påvisning av patologiske og histopatologiske forandringer som er typiske for ILA og
2. Påvisning av ILA-virus hos samme individ ved immunhistokjemi og real-time RT-PCR – eller annen metode for påvisning av virus (f.eks. dyrkning)

Man kan velge blant flere metoder for å påvise ILA-virus. Disse er:

• • IFAT på nyreceller
• • Immunhistokjemi (tas prøver fra hjerte, lever, milt, nyre, pankreas, hud og skjelettmuskulatur)
• • RT-PCR (nyre på RNAlater)
• • Serologi (serumprøve)
• • Cellekultur (nyreprøve på transportmedium)

Generelt sies følgende: For å stille diagnosen ILA skal ILA-virus påvises ved hjelp av minst to ulike metoder med uavhengige påvisningsprinsipper. ILA-virus m. påvises med antistoffer i vevspreparater. I tillegg m. ILA-virus påvises enten med RT-PCR eller ved dyrkning i cellekultur. Påvisning av virus med antistoffer og PCR bør skje fra samme fisk.

Tiltak

Anlegg (matfisk) med diagnose

• • Raskt opptak av smitta fisk er det viktigste tiltaket for å redusere risiko for smittespreiing
• • Påvist smitte av alvorlige sjukdom blir alltid regnet for å gjelde hele lokaliteter i sjø.
• • I landbaserte anlegg kan rutiner for drift og smitteskille bli vurdert.
• • Påvist smitta merder skal tømmes først og så raskt som mulig.
• • Ikke-smitta merder skal tømmes innen kort frist.

I stamfiskanlegg med diagnose

• • All fisk, rogn og mjølke skal destrueres omgående.
• • Vurdere nøye hva som skal skje med rogn produsert før mistanke oppsto, ut fra epidemiologiske undersøkelser. Prøvetaking av rogn er usikkert.
• • Vurderinger av hvor smitte kom inn og strenge krav til smitteskille i produksjonen for å unnta deler av anlegg.
• • Vurdere melding til og oppfølging av anlegg som har fått levert yngel, smolt eller rogn før mistanken oppsto.

I tillegg kommer klinikk og obduksjon. Hos fisk som døde på grunn av ILA vil man ofte finne følgende patologiske forandringer:

• • Bleke gjeller (grunnet anemien)
• • Mørk lever (grunnet hemorrhagisk lever nekrose)
• • Forstørret milt (stuvning)
• • Blodige tarmer (grunnet blødninger i submucosa)
• • Anemi
• • Blodstuvning i gjellefilamentene

Ved en del tilfeller av ILA vil en bare finne anemi og tegn på sirkulasjonskollaps, ofte tidlig i et sykdomsutbrudd (7).

Overlevelse av virus utenfor verten

Hvor lenge ILA virus overlever utenfor verten er ikke kjent, men studier har vist at ILA viruset har overflateproteiner (særlig HE) som er «designet» gjennom evolusjonen til å tolerere høy saltkonsentrasjon uten at det oppstår strukturendringer i proteinet. UV-stråling og strømninger i sjøen vil påvirke virusets levetid. Viruset klarer seg godt i et relativt bredt pH-spekter, og er infektivt fra pH 5-9. pH utenfor dette intervallet vil redusere levetiden og infektiviteten.

Smittekilde

Utbrudd av ILA etter sjøsetting opptrer enten som primærutbrudd, hvor det er gode indikasjoner for at disse utbruddene oppstår som et resultat av en delesjons-mutasjon i HPR-regionen av en full-lengde-versjon av HE, antagelig med flere forutgående mutasjoner i andre deler av virusgenomet. Spredning (klonal ekspansjon) fra et primærutbrudd omtales som sekundærutbrudd. Da er det genetiske slektskapet mellom virusvarianten fra primær- og sekundærutbruddet meget nært beslektet, men det introduseres mutasjoner selv hos høyvirulente varianter av viruset.

Kilde for introduksjon av smitte er ikke fullt ut klarlagt. Vill-laks bærer viruset, og man har også funnet viruset i vill sjøørret. De varianter (HPR0) som finnes hos vill laksefisk samsvarer ikke med de genetiske varianter som finnes hos oppdrettslaks og dermed er forekomst at ILA hos oppdrettslaks sannsynligvis ikke knyttet til smitte fra villaks. Replikasjon av viruset kan eksperimentelt forekomme i brunørret, røye, coho laks, chum laks og torsk.

Epidemiologi

I 2013 ble det påvist en markant økning av antall kliniske utbrudd av ILA; det var 10 rapporterte tilfeller med 8 i Nordland, 1 i Troms og 1 i Sogn og Fjordane. Året før (2012) var det kun 2 rapporterte tilfeller, begge i Møre og Romsdal. I 2014 og 2015 var antall rapporterte tilfeller henholdsvis 10 og 15, mens antall tilfeller i 2016 var 12. Det er i særlig grad i Troms fylke at ILA har vært et problem. I 2020 ble ILA diagnostisert på 23 lokaliteter, spredt langs hele kysten, 25i 2021 og 15 i 2022.

Bekjempelsesmetoder

Ved et utbrudd er nedslakting det akuttiltaket som blir benyttet. Det blir gjort for å hindre smitte til andre nærliggende anlegg. Det bør gjøres så raskt som mulig slik at minst mulig virus blir spredt i forbindelse med utbruddet.

I et slakteri vil det være igjen mye restavfall og blod etter at fisken er ferdig prosessert. Spesielt fisk som er slaktet etter et ILA-utbrudd utgjør en høy smitterisiko og vann og slakteavfall vil desinfiseres. Restavfall blir som regel ensilert til en pH under 4. Dette gjøres også med dødfisk på oppdrettsanlegget. 

Bekjempelsessoner

Når man påviser ILA i en merd er resten av anlegget å oppfatte som smittet. Det er også en mulighet for at viruset befinner seg i miljøet rundt anlegget. Et nærliggende anlegg kan også være smittet uten at man har påvist smitte. Det opprettes en bekjempelsessone rundt anlegget (Figur 19). Størrelsen på sonen baseres på det første utbruddet og den tar hensyn til topografien og vannstrømningene i området. Sonen kan være formet på mange forskjellige måter som følge av de naturgitte forholdene i området. Innenfor denne sonen kan det ligge flere anlegg. Det opprettes soner rundt disse til tross for at det ikke er påvist ILA der. Den felles sonen vil kunne ha en radius på mer en fem kilometer. Alle anlegg i en slik sone vil bli pålagt restriksjoner, blant annet forbud av innførsel og utførsel av fisk fra området eller man kan slakte ned anleggene der i løpet av kort tid. Ved å bruke en bekjempelsessone kan man da favne om hele det området hvor smitteagens er til stede. På den måten hindres spredningen av smitte til anlegg utenfor området. Anleggene i denne sonen blir pålagt økt prøvetakning, 20 fisk pr uke fra hvert anlegg.

Ved de første utbruddene i Norge brukte man ikke bekjempelsessoner. Sonene ble først introdusert i 1992. Dette ble videreført i de offisielle retningslinjer for håndtering av utbrudd. Der ble det lagt til et forbud mot å sette ut fisk i bekjempelsessonen, samt en felles brakklegging av hele området på minimum en måned. I bekjempelsesplanen av 2003 ble det forbud mot flytting av fisk uten godkjenning. Man måtte også rapportere dødeligheten hver uke og det ble lagt restriksjoner på transporten gjennom sonen. Sonen kunne oppheves etter at all fisk der er slaktet ut, anlegg og utstyr er rengjort/desinfisert og brakkleggingsperioden er overholdt.

Preventive tiltak – generasjonsskifte

Generasjonsskifte eller “all inn/all out” er en viktig faktor i bekjempelsen av sykdom hos fisk. Her er poenget å slakte ut hele den generasjonen som står i anlegget før man setter inn ny fisk. Mange av de fiskene som står i merdene kan være smittebærere. Ved det første utbruddet av ILA i Norge i 1984 var det ikke vanlig med generasjonsskifte. Dette kom som en reaksjon på utbruddene av furunkulose og ILA på slutten av 80-tallet og begynnelsen av 90-tallet.

Brakklegging

ILA virus kan under optimale forhold overleve opptil 20 uker utenfor verten, selv om alle . Dette er nok mye lenger enn hva som er tilfelle i naturen, men det gir en indikasjon om at generasjonsskifte ikke er nok for bekjempelsen av ILA. I tillegg trenger man blant annet en brakkleggingsperiode. Dette er en periode hvor hele anlegget er tomt for fisk (ligger brakk). I dette tidsrommet vil virus generelt ha “tilgang” til langt færre verter, og de som er spesifikke for atlantisk laks vil være helt uten verter. Brakklegging er også et akutt tiltak som brukes ved utbrudd. Etter en nedslaktning ved et utbrudd er det spesielt viktig med brakklegging. Det vil etter nedslaktningen være mye smitte i og rundt anlegget. Varigheten av brakkleggingen skal være minst 2 måneder etter at fisken er slaktet ut.

Overvåkningssone

I en overvåkningssone (Figur 20) skal anlegg med laksefisk i sjø ukentlig oversende Mattilsynet lister som viser den daglige dødeligheten av fisk på merdnivå. Anlegg med laksefisk i sjø skal i tillegg minst ha månedlig helsekontroll med prøveuttak (20 fisk) egnet til å avdekke eventuell ILA-smitte. Undersøkelsene skjer ved PCR metoder av godkjente laboratorier.

Etter at all fisk fra anleggene i bekjempelsessonen er fjernet, anlegg og utstyr forskriftsmessig rengjort og desinfisert, lokalitetene har gjennomført en samordnet brakklegging av bekjempelsessonen i minimum to måneder og anlegg der det er påvist ILA er brakklagt i minimum tre måneder, kan Mattilsynet vedta at bekjempelsessonen skal oppheves. Da oppheves også overvåkningssonen.

Vaksinering

I Norge ble det første gang vaksinert mot ILA i Midt-Troms i 2009 og i årene som fulgte har bruken av ILA vaksinering økt. De siste årene har en stor andel av sjøsatt fisk blitt vaksinert med en kombinasjonsvaksine med til sammen 7 ulike antigener. Det er gode indikasjoner for at antall utbrudd reduseres ved vaksinasjon og at risikoen for utbrudd reduseres betydelig. Det er ikke anledning å vaksinere laks i soner hvor det holdes stamfisk i sjø eller i soner som erklært ILA-fri.

På Færøyene har all sjøsatt laks blitt vaksinert siden 2005, og det har ikke vært utbrudd med høyvirulente varianter av ILA virus siden vaksinasjonen startet. I 2009 ble det tatt i bruk en vaksine basert på Chilenske eller norske isolater (som er tilnærmet identiske med de Chilenske). I dag pålegger myndighetene at all laks som sjøsettes i Chile er vaksinert og etter at vaksinen ble tatt i bruk har antall utbrudd gått ned og man har kun hatt noen få utbrudd av ILA etter av vaksineringen startet. Dødeligheten i disse tilfellene har også vært meget lav (<5%).

Pankreassykdom (PD)

Salmon pancreas disease virus (SPDV) er det offisielle navnet på viruset som forårsaker pankreassykdom (pancreas disease, PD). Det samme viruset betegnes også Salmonid alphavirus (SAV). SPDV/SAV forårsaker alvorlig sykdom hos atlantisk laks og regnbueørret i Europa. SAV gir PD i oppdrettslaks i Irland, Skottland og Norge. Sleeping disease virus (SDV) er forårsaket av infeksjon med subtype SAV 2 og infiserer regnbueørret oppdrettet i ferskvann. SD var kjent lenge før viruset ble påvist og virus som årsak til infeksjonen ble bekreftet ved isolering av SDV i Frankrike. SAV 1, 2, 4, 5 og 6 har vært de dominerende subtyper i Skottland og Irland. I Norge er subtype 3 er den dominerende varianten mens subtype 2 (marine type/variant) er dominerende i Trøndelag fylke, første gang påvist i 2012.

Alphavirus – struktur og genomisk organisering

Salmon alphavirus (SAV)/salmon pancreas disease virus (SPDV) tilhører slekten Alphavirus. Alphavirus tilhører familien Togaviridae. SAV er de eneste virusartene som infiserer fisk og overføres ikke med vektor.

Varianter av SAV

Organiseringen av genomet til SAV-3 er identisk med SAV-1 og SAV-2, og nukleotidsekvenslikheten mellom SAV-1 og SAV-2 er henholdsvis 91,6% og 92,9%. Subtyper av SAV er karakterisert på basis av partielle sekvenser av nsP3 (ikke-strukturelt protein) og overflate-proteinet E2 (de to mest variable regioner i genomet). Inndelingen i subtyper er vist i Tabell 3. Subtype 4 finnes i Irland og Skottland, subtype 5 i Skottland og subtype 6 i Irland.

Tabell 3. Varianter av salmonid alphavirus (SAV). Det benyttes som regel forkortelsen SAV når det refereres til PD virus, men det offisielle navnet er salmonid pancreas disease virus (SPDV).

Subtype	Betegnelse på virus	Art som infiseres
SAV1	Salmonid pancreas disease virus (SPDV)	Regnbueørret Atlantisk laks
SAV2	Sleeping disease virus (SDV) SAV2 marine	Regnbueørret Atlantisk laks
SAV3	Norwegian salmonid alphavirus	Regnbueørret Atlantisk laks
SAV4-6	Skotske og irske varianter	Regnbueørret Atlantisk laks

Strukturelt består alphavirus av en icosahedral nukleokapsid som er omsluttet av en membran fra vertscellen hvor glykoproteinene er anordnet i et icosahedralt gittermønster (Figur 21). Glykoproteinene E1 og E2 som forbinder heterodimer subenheter, er i sin tur satt sammen til å danne trimere utstikkere. E1 og E2 er transmembrane proteiner med C-terminale cytoplasmatiske regioner som interagerer med nucleocapsidet.

Epidemiologiske forhold

PD gir en syk fisk med kliniske symptomer og med typiske histopatologiske funn og hvor PD-virus påvises i de samme individer. PD blir påvist gjennom hele året, med flest påvisninger i sommermånedene særlig av SAV3, mens SAV2 har en høyere forekomst om høsten. Det er en erfaring at PD-utbrudd i SAV2-området (Figur 22) gir relativt lav dødelighet.

SAV 3

Antall SAV3 tilfeller har vært relativt stabilt over de siste 10 årene med en liten dipp i 2013 (Figur 23). Det er fortsatt Hordaland som har det høyeste antall påviste / diagnostiserte tilfeller. I 2017 var det igjen en markert økning i antall rapporterte tilfeller av SAV3 infeksjoner, og disse påvises hyppigst sør for Møre og Romsdal og ned til Jæren mens antall tilfeller i periode 2018-2020 har falt litt tilbake. I 2021 var det en markert nedgang i antall rapporterte tilfeller.

SAV 2

Det var en kraftig økning i antall SAV2-tilfeller i 2012 sammenlignet med foregående år (Figur 24). Det var 4 påvisninger i 2011 og dette økte til 46 tilfeller i 2012. Over de siste 3 årene har det vært flest påvisninger i tidligere Sør-Trøndelag og Møre og Romsdal med noen få påvisninger i Nord-Trøndelag. PD forskriften sier at påvisning av virus er tilstrekkelig for å utløse mistanke om PD, men det skal påvises patologiske forandringer i indre organer for at tiltak skal iverksettes (se mer detaljer nedenfor). Håndteringen av SAV2 infeksjoner har vakt mye diskusjon særlig fordi det i mange tilfeller knapt påvises klinisk sykdom og det er kun et fåtall fisk med forandringer og dette har medført et nytt overvåknings- og kontrollregime.

Bekjempelse og kontroll

Det opereres med en #overvåkningssone som går fra Flatanger (Trøndelag) til grensen mellom Norge og Russland, og fra Jærens rev til grensen mellom Norge og Sverige. Nord for (Nord)Trøndelag og fra Jærens rev til svenskegrensa skal SAV-infeksjon bekjempes ved å fjerne fisken så raskt som mulig fra anlegg (utslakting). I tillegg er det definert en #PD-sone som går fra Jærens Rev til Flatanger (Trøndelag).

Generelle bestemmelser

Det er etablert en overvåkningsprosedyre:

• • Fisk, unntatt rensefisk, i akvakulturanlegg med ubehandlet sjøvann der SAV ikke er påvist, skal undersøkes for SAV minst en gang i måneden. Ved hver undersøkelse skal det tas ut prøver av hjerte og nyre fra minst 20 fisk
• • Fisk som skal flyttes fra akvakulturanlegg med sjøvann til andre akvakulturanlegg, unntatt av slaktemerder, skal undersøkes for SAV i løpet av de tre siste ukene før fisken flyttes. Det skal tas ut prøver av hjerte og nyre fra minst 60 fisk. Fisk skal ikke flyttes før analyseresultatene foreligger. Dette betyr også at fisk som kommer fra settefiskanlegg som har tatt inn ubehandlet sjøvann må testes før utsett (n=60).

Mistanke om PD (i begge soner)

Ved mistanke om PD i et akvakulturanlegg der sykdommen ikke er påvist, skal det umiddelbart tas ut 10 nye prøver av hjerte og nyre som analyseres med PCR og som regel vil det tas en full organpakke som overføres til formalin, samt vev fra hjerte og nyre på RNAlater fra minst 10 fisk til Nasjonalt referanselaboratorium (Vetinst). I overvåkingssonene skal det også tas ut vev på virustransportmedium fra de samme 10 fiskene for dyrkning og sekvensering for å bestemme subtype.

Dersom det oppstår mistanke om PD som ikke blir bekreftet gjennom analyser av prøver etter beskrivelsen ovenfor, skal det søkes å bekrefte eller avkrefte mistanken gjennom følgende prøvetakingsopplegg:

• • Det skal tas ut prøver av hjerte og nyre fra minst 60 fisk minst 1 gang i måneden i 4 måneder etter siste positive prøve. Negative prøver over denne perioden vil avkrefte diagnosen.
• • Det er i dag ikke et påbud om vaksinasjon, men en stor andel av fisken som settes i sjøen i Overvåkningssonen er vaksinert.

PD-sone

Når SAV er påvist i et akvakulturanlegg i PD-sonen, kan Mattilsynet etter en vurdering av smittesituasjonen pålegge at fisk i akvakulturanlegg nord for Hustadvika med påvist PD med subtype el. genotype SAV3, skal slaktes eller destrueres. Mattilsynet kan også tillate at fisken flyttes til PD-sonen sør for Hustadvika for videre vekst før slakting dersom smitterisikoen er lav. Valg av transportrute skal godkjennes av Mattilsynet.

Mattilsynet kan fatte vedtak om å tømme akvakulturanlegg med påvisning av PD av alle subtyper/genotyper av SAV, dersom hensynet til å begrense smittespredning tilsier det.

Overvåkningssonen

Når SAV er påvist i et akvakulturanlegg i overvåkingssonen, skal akvakulturanlegg innenfor en radius på 30 km fra det berørte akvakulturanlegget, eller akvakulturanlegg utenfor dette området som har hatt kontakt som medfører smitterisiko, undersøkes innen 7 dager for å dokumentere smittestatus.

Mattilsynet kan etter en vurdering av smittesituasjonen pålegge at fisk i akvakulturanlegg der PD påvises, skal slaktes ut eller destrueres. Mattilsynet kan også tillate at fisken flyttes til PD-sonen for videre vekst før slakting dersom smitterisikoen er lav. Valg av transportrute skal godkjennes av Mattilsynet.

Oppdrettsnøter fra akvakulturanlegg med mistanke om eller påvist PD skal transporteres i tett beholder, og alt avrenningsvann fra beholderen skal samles opp på notvaskeriet og desinfiseres.

Kilde til infeksjon

Det er seks subtyper av SAV basert på sekvensering av Nsp3 og E2 genene. Full-genomsekvensering tyder på at alle seks subtypene divergerte før det tjuende århundre, tidligere enn de første forsøkene på å introdusere og oppdrette regnbueørret i Europa. Forståelsen er derfor at subtypene vi i dag har identifisert må ha eksistert i et vilt reservoar (ennå uidentifisert). Interessant nok har stammer av hver undertype, bortsett fra undertype 2, en felles opprinnelse som eksisterte etter 1970-tallet, som er på den tiden da moderne lakseoppdrett startet. De(n) originale varianten(e) vil sannsynligvis representere uavhengige introduksjoner til oppdrettsfiskpopulasjoner fra det ville reservoaret. Hver undertype har senere utviklet seg til selvbærende epizootier.

For SAV3 er det bevis for kun én introduksjon fra villfisk til oppdrettslaks i Norge, og som senere divergerte. Introduksjonen faller sammen med tidspunktet for de første rapportene om pankreassykdom i Norge og nylige utbrudd av subtype 2 i Norge (marin SAV2) representerer en ny (annen) introduksjon av SAV til Norge. Kilden er ikke kjent, men det er nær genetisk slektskap med varianter sekvensert fra skotsk oppdrettslaks av SAV2. Dette gjør det sannsynlig at et virus først ble introdusert til laks i Skottland og at spredningen til Norge er knyttet til import av biologisk materiale fra Skottland.

Patogenesen og histopatologiske forandringer ved PD

Smitteveiene for SAV er ikke helt avklart, men smitte skjer i stor grad via vannmassene. Kohabitanter som settes sammen med eksperimentelt infisert fisk utvikler PD og opptreden av de forandringene i indre organer er noe forsinket (tidsmessig) i forhold til når de opptrer hos fisk som smittes med injeksjon. Det ser også ut til at virus har en tidlig replikasjon i nyre og/eller i milten før det skjer en rask oppformering i pankreas og hjertemuskulatur. Forandringene i pankreas og hjerte opptrer nesten samtidig og er karakterisert ved apoptose av enkelt-celler i eksokrin pankreas etterfulgt av nekrose (Fig. 25A). Forandringene brer seg raskt til å omfatte hele pankreas og etterfølges av betennelsescelleinfiltrasjon med lymfocytter (Fig. 25B) og senere noen makrofager. Senere i forløpet vil hele den eksokrine pankreas gå tapt (Fig. 25C). Hvis fisken overlever, vil pankreas langsomt kunne regeneres tilbake til nesten normal funksjon. Hvor lang tid dette tar under feltforhold er ikke kjent, men i eksperimentelle studier har man sett god regenerasjon ved 16 uker etter smitte.

I hjertemuskulaturen ser man i tidlige stadier henfall av enkelte cardiomyocytter (Fig 25E). Disse forandringene finnes som regel i den spongiøse delen av hjertet, ofte i overgangen mellom kompakt og spongiøs del. Forandringene brer seg til etter hvert å omfatte hele hjertemuskulaturen, mest uttalt i den spongiøse delen av hjertet (Fig. 25F). På dette stadiet ses også en moderat til uttalt infiltrasjon med betennelsesceller, dominert av lymfocytter (Fig. 25F).

I senere stadier ses det også forandringer i skjelettmuskulaturen og disse forandringene omfatter både rød og hvit muskulatur (Figur 26). Forandringene er karakterisert ved henfall av muskelceller og betennelsescelleinfiltrasjon med lymfocytter i makrofager i interstitielt vev og i muskelceller (fagocytose av degenerert vev; Figur 26). Ofte vil den hvite muskulaturen også være inndratt i forandringene og disse er karakterisert ved henfall / nekrose av muskelfibre (-celler), svært ofte enkelt-celler. Det kommer raskt en infiltrasjon med betennelsesceller i interstitielt muskelvev (intermuskulært bindevev) bestående av lymfocytter og makrofager (Figur 27). Betennelsescellene infiltrerer også degenerert og nekrotiske celler, særlig makrofager, som vil «rydde opp»/fagocytere nekrotiske vevsrester.

Kardiomyopatisyndrom (CMS)

Kardiomyopatisyndrom (CMS) ble først identifisert og diagnostisert i Norge i 1985. Årsaken til sykdommen var ikke var kjent den gangen. Fra 1985 har det årlig blitt påvist CMS hos 100-180 anlegg. I desember 1997 ble CMS for første gang identifisert i Skottland, med en dødelighetsrate på 60 % blant fisk som veide 5-7 kg. Etter år 2000 har det blitt påvist hos vill atlantisk laks i Norge og Canada, samt hos Chinook-laks (Oncorhynchus tschawytscha) i Canada. Offisiell statistikk over CMS-utbrudd i Norge har vært tilgjengelig siden 2006. Fra og med 2018 har CMS vært den mest tapsbringende virussykdommen i Norge, og den påvises langs hele kysten.

En viral årsak til CMS ble foreslått allerede etter den første påvisningen av sykdommen. Viruspartikler ble imidlertid ikke funnet ved transmisjonselektronmikroskopiske undersøkelser i to uavhengige studier. Isolering av viruspartikler fra hjerte-, milt- eller nyre i cellekultur mislyktes. CMS ble foreslått som en sen tilstand av HSMI i 2006 og forbindelser til tidligere utbrudd av IPN ved samme oppdrettsanlegg ble også diskutert. Foruten en viral årsak har autoimmune reaksjoner blitt foreslått som en mulig årsak til CMS.

Den første vellykkede eksperimentelle smitte ble publisert i 2009. I denne studien ble hjerte-homogenat fra et feltutbrudd brukt til å infisere fisk laks hvor det ble påvist CMS-spesifikke forandringer i atriet 6 uker etter smitte og 12 uker etter smitte ble de første forandringer påvist i ventrikkelen. I 2011 ble et nytt virus med slektskap til Totiviridae-familien identifisert fra fisk med CMS. Dette viruset ble kalt piscine myokardittvirus (PMCV) og forårsaker CMS.

Patologi

Diagnosen CMS er basert på kliniske tegn, makroskopiske funn ved obduksjon og histopatologiske forandringer i hjertet. Fisk dør akutt av CMS («hjertesprekk») og hjertetamponade er et typisk funn (Figur 29). Tamponaden er forårsaket av en ruptur av atriet eller Sinus venosus. Dette resulterer i hjertestans og fisken dør umiddelbart. Ødem i skjellommene (skjellommeødem) skyldes sirkulasjonskollaps og det samme gjelder fibrinutsvedning på leveroverflaten, samt mørkfarging av leveren. Klinisk sykdom påvises vanligvis 12 – 18 måneder etter overføring til sjø, men kliniske tilfeller av CMS har også blitt diagnostisert noen måneder etter sjøsetting. Dermed rammer CMS stort sett stor fisk noen måneder før den når slaktevekt og i de fleste tilfeller dør tilsynelatende frisk fisk uten forutgående symptomer.

Histologisk ses lesjoner kun i atriet og den svampaktige delen av ventrikkelen (Figur 30). Tidlige lesjoner er preget av fokale, inflammatoriske foci i atriet som regel subendotelialt.

Lesjonene øker i antall og blir etter hvert diffuse og kan omfatte mesteparten av atriet. Forandringene i ventrikkelen ligner de som er beskrevet for atriet, fokale initielt, utvikler seg til multifokale lesjoner og med diffus utbredelse i de mest uttalte stadier. Forandringene starter som en betennelse, utvikler seg til en betennelse med myocard-nekrose hvor sarcoplasma fylles med betennelsesceller. Betennelsescellene er i tidlig fase dominert av lymfocytter og noen nøytrofile granulocytter og med økende antall makrofager etter hvert. I senere stadier er det en god blanding av alle typer betennelsesceller. Endotelcellene i atriet og ventrikkelen blir forstørrede (hypertrofiske) og de øker også i antall (hyperplasi). Virus kan påvises i kardiomyocytter med ulike in situ metoder (Figur 31, Figur 32).

I senere stadier påvises betennelse og alvorlig myokardskade, i de mest uttalte tilfeller er det få intakte celler i atriet og det svampaktige laget av ventrikkelen. I kroniske stadier kan det påvises reparative reaksjoner med økt bindevevsdannelse.

Det kompakte laget av ventrikkelen er ikke omfattet av forandringene og heller ikke hjertets epikard.

Ultralydundersøkelse og ekkokardiografi av fisk med CMS viser et utvidet atrium, og hjerteventrikkelen komprimeres i terminale stadier av CMS. Væske i pericardhulen kan observeres. Andre symptomer som hudblødning og skjellødem er rapportert i forbindelse med CMS. Ved obduksjon av død fisk finnes hjertetamponade, ascites og fibrinbelegg på lever. Histopatologisk undersøkelsen av hjertevev vil være tilstrekkelig for å stille diagnosen CMS og en samtidig PCR analyse vil konfirmere infeksjon med PMCV.

Epidemiologi

CMS påvises langs hele kysten i alle produksjonsområder (Figur 34) og antall rapporterte tilfeller har vært mellom 100 og 200 over de siste årene. CMS er ikke en rapporteringspliktig sykdom og av den grunn vil ikke alle tilfeller diagnostiseres/rapporteres. En feltundersøkelse av CMS-utbrudd i Norge rapporterte gjennomsnittlig akkumulert dødelighet på 6,1 % opp til 20 %. De fleste tilfellene diagnostiseres 10-12 måneder etter sjøsetting. Det er vanskelig å anslå tapene, men i dag utgjør CMS den virusinfeksjonen som høyest tap.

Ifølge den årlige fiskehelserapporten fra Veterinærinstituttet det 85 oppdrettsanlegg diagnostisert med CMS i 2007. Antall tilfeller har variert fra år til år (Figur 28), og mye av variasjonen skyldes manglende koordinering av rapporterte antall tilfeller for offentlige og private laboratorier. I 2020 er det rapportert 150, og i 2021 155 tilfeller.

Piscint myokarditt virus

PMVC har et genom som består av 6688 nukleotid og er et dsRNA-virus. Genomet er organisert med tre åpne leserammer (ORF) (Figur 35). ORF 1 koder for det antatte kappeproteinet (CP) med en lengde på 861 aminosyrer (aa), det overlapper med ORF 2, som koder for virusets polymerase (RdRp). ORF 3 koder for et protein som er bygd opp av 302 aminosyrer og er et protein uten likhet med noen andre proteiner. Det vist en svak homologi med et C-X-C-motiv (et chemokin). Funksjonen til proteinet er ikke fullt klarlagt, men kan ha noe med spredningen av virus fra celle til celle og fra fisk til fisk.

Den antatte RdRp av PMCV er et protein med en lengde på 726 aa og viser nærmest homologi med gag-pol-fusjonsproteinet til Giardia lamblia-viruset (GLV), et virus fra totivirusfamilien og RdRp til infeksiøs myonekrose-virus som gir sykdom hos reker. Totivirus er infiserer hovedsakelig sopp og protozoer.

Studier av genomsekvensen til PMCV fra ulike produksjonsområder i Norge samt fra andre land viser at viruset generelt er relativt homogent med lite variasjon (mutasjoner) i alle deler av genomet. Det området i virusgenomet som viser størst variasjon innen og mellom utbrudd er ORF3. I de fleste utbrudd er en variant av viruset til stede (basert på sekvensdata) og over tid øker variasjonen (mutasjonen) innen og mellom fisk. Det er generelt ikke noe mønster i de mutasjoner som oppstår, noe som kan skyldes at viruset fortsatt «tilpasser» seg til verten.

Hjerte- skjelettmuskelbetennelse (HSMB)

Hjerte- og skjelettmuskelbetennelse (HSMB) ble første gang beskrevet i 1997og klinisk sykdom oppstår vanligvis 6-7 måneder etter overføring til sjø. HSMB ble dokumentert ved å injisere hjertehomogenat fra syk fisk i frisk fisk som utviklet typiske sykdomsforandringer for HSMB. I 2010 ble viruset karakterisert og fikk navnet piscint ortoreovirus (PRV). Viruset kan ikke dyrkes i ordinære cellekultur, men kan oppformeres i røde blodceller (erythrocytter). Sykdommen kan reproduseres ved injeksjon av virus dyrket i erythrocytter. PRV er også funnet i villaks.

Kliniske symptomer og makroskopiske forandringer

Kliniske utbrudd av HSMB gir lav til moderat dødelighet, opp til 20 %, mens morbiditeten er nær 100%. Fisk kan være uten tydelige ytre tegn, mens obduksjonen kun viser moderate sirkulasjonsforstyrrelser. De makroskopiske forandringene omfatter et blekt hjerte, en blodfylt lever (stuvning), noen ganger med et fibrinøst eksudat på leveroverflaten. Milten er ofte forstørret og med mørk farge (Figur 36). Det finnes ingen blødninger i skjelettmuskulaturen.

Som nevnt ses kliniske symptomer rundt 6-7 måneder etter overføring til sjø, som sammenfaller med 1800-2000 døgngrader etter overføring. Det har også vært flere rapporter om forekomst av HSMB i ferskvann som også kan forveksles med sykdommer som hemorragisk smoltsyndrom (HSS), en sykdom med ukjent etiologi.

PRV

PRV, piscine orthoreovirus, er et nakent, dobbelttrådet RNA virus, ikosahedrisk med dobbel kapsidstruktur og med en størrelse på ca. 80 nm i diameter. Det ytre kapsidet har en T=13 symmetri og den en T=2 symmetri (Figur 37). Genomet består av 10 segmenter og PRV som infiserer laks i Norge betegnes PRV1, mens HSMB-lignende sykdom hos regnbueørret er forårsaket av PRV3. PRV2 forekommer hos coho laks i Japan. Det er også påvist varianter av PRV1 i Norge og med virulensforskjeller mellom de ulike variantene. De første påvisningene av HSMB var forårsaket av en lavvirulent variant mens utbrudd de siste årene er forårsaket av en ny variant med høyere virulens.

Virus spres gjennom vann og i tidlige stadier påvises virus i hodenyre og milt og replikasjonen skjer i røde blodlegemer i såkalte virusfabrikker. Virus spres med erytrocytter til epikard og så over til myokard hvor infeksjonen starter i det kompakte laget og sprer seg innover til den spongiøse delen av ventrikkelen (Figur 38). Overflateproteinet sigma-1 (Figur 37) binder seg sannsynligvis til reseptoren til målceller, men det er ikke klarlagt.

Mekanismer for immunitet er ikke kjent, men vaksinasjon med hel-virus (opprenset9 gir en viss grad av beskyttelse mot opptreden av typiske histopatologiske forandringer i hjertet. Basert på generell kunnskap fra andre reovirus spiller trolig sigma3 og mu1 en viktig rolle for beskyttelse.

Histopatologi

De histopatologiske forandringene sees i hjerte- og skjelettmuskulatur. De sekvensielle endringene etter eksperimentell smitte består først av en infiltrasjon med lymfocytter i hjertets epikard, med gradvis opptredene av forandring i ventrikkelen, først i kompakt del, dernest i den spongiøse delen (Figur 38). Infiltrasjonen i kompaktlaget i ventrikkelen løper langs små blodårer (koronarkar). Endringer i kompaktlaget blir etterhvert diffuse og involverer den spongiøse delen av ventrikkelen og forandringene består av infiltrasjon med lymfocytter og degenerasjon og nekrose av kardiomyocytter.

Viruset kan påvises in situ ved hjelp av immunhistokjemi og spesifikke antistoffer mot mu1-proteinet (Figur 39).

Endringer i skjelettmuskulaturen ses hovedsakelig i rød muskulatur. De første forandringene er karakterisert ved en interstitielle forandringer karakterisert ved hypertrofierte intermuskulære celler, og mild infiltrasjon av lymfocytter (Figur 40B). Endringer i myocyttene ses som degenerasjon ledsaget av infiltrasjon med lymfocytter og noen få makrofager (Figur 40C). På senere stadier ses diffuse forandringer med interstitiell infiltrasjon av lymfocytter og degenerasjon og nekrose av muskelfibre (Figur 40D).

Diagnose

Diagnosen er basert på kliniske sykdomstegn, som generelt sett er lite karakteristiske; dårlig appetitt og økt dødelighet. Makroskopiske endringer og histopatologisk undersøkelse av hjertevev og skjelettmuskulatur ved lysmikroskopi, kombinert med PCR-analyse, gir godt grunnlag for å stille en etiologisk diagnose.

Patogenese

Eksperimentelle smittestudier viser at det tar 6-8 uker fra smittetidspunkt til de første tegnene til forandringer i hjertet påvises (#). Ved eksperimentell smitte basert på virus dyrket i cellekultur er det vist at atlantisk laks får typiske forandringer i hjerte- og skjelettmuskel. PRV replikerer i hjertevev som faller sammen med ekspresjon av det antivirale Mx-proteinet og replikasjon av virus målt ved qPCR, korrelerer med utvikling av hjertelesjoner. Det er vist at lymfocyttene som infiltrerer hjertevevet domineres av CD8⁺ T-celler og virusreplikasjonen når toppen noen dager før den inflammatoriske responsen. Dette peker mot en klassisk virusindusert cellulær immunrespons og økningen i CD8⁺ T-celletall kombinert med en økt ekspresjon av granzym A som indikerer en cytotoksisk T-cellerespons. Sammen med CD8-responsen er det en økning i antall CD4+ T-hjelpeceller i inflammert område (kompaktlag og epikard). En parallell ekspresjon av IFNγ støtter videre tilstedeværelsen av aktiverte cytotoksiske T-celler og T-hjelper 1-celler.

HSMB/PRV infeksjon og svarte flekker

Det er publiserte data (4) som peker på en mulig sammenheng mellom PRV-infeksjon og forekomst av svarte flekker i hvit muskel (Figur 41), men den nøyaktige sammenhengen mellom tilstedeværelsen av makrofager som huser virus og utviklingen av de svarte flekkene er ikke fullt ut klarlagt. Svarte flekker forekommer uten av PRV påvises, men det synes som at PRV aktiverer makrofagene slik at inflammasjonen forsterkes, noe som også forklarer økt ansamling av melanomakrofager.

Epidemiologi

HSMB ble rapportert fra 188 anlegg i 2021 og 160 anlegg i 2022 (Figur 42). HSMB er ikke en meldepliktig sykdom og antall rapporterte tilfeller inkluderer diagnoser stilt ved offentlige og private laboratorier. De fleste tilfeller er rapportert fra sjøvann, men det er også noen få tilfeller i ferskvann. Dette peker mot en vertikal overføring, men det er ikke dokumentert. Det er økt risiko for HSMI-utbrudd på anlegg/lokaliteter hvor HSMI har vært diagnostisert tidligere år. Lokaliteter hvor HSMB er påvist i 2022 er vist i Figur 43.

Referanseliste